Найден способ проще получать белки

Группа учёных из Лаборатории перспективных исследований мембранных белков МФТИ предложила метод, который позволит существенно упростить получение ценных белков для дальнейшего изучения.

Подход, изложенный в журнале PLOS ONE, может заметно снизить как стоимость, так и продолжительность исследований, которые порой длятся многие месяцы.

Проведённое исследование относится к области структурной биологии, одной из ключевых задач которой является получение структур разнообразных белков. Только в человеческом геноме их зашифровано, по разным оценкам, от 20 до 25 тысяч. Интереснее всего для учёных и фармацевтов белки, с помощью которых клетки «общаются» с окружающим миром – мембранные белки, составляющие примерно четверть от общего количества зашифрованных белков. Однако пока известна структура всего лишь 3% мембранных белков, в то время учёные выяснили структуру около половины белков человека. Но именно мембранные белки в большинстве случаев являются мишенями для лекарств, и на их изучение тратятся огромные деньги и усилия учёных и фармацевтических компаний во всём мире. За получение структуры конкретных мембранных белков – рецепторов, сопряжённых с G-белками, – американские учёные Роберт Лефковиц и Брайан Кобилка в 2012 году получили Нобелевскую премию.

Чтобы расшифровать структуру белка прежде всего необходимо получить его в достаточном количестве. Самым простым и дешёвым методом для этого является экспрессия в клетках E. coli – кишечной палочки, неприхотливой и наиболее изученной бактерии. Для этого ген, кодирующий нужный белок, вводят в клетки E. coli, заставляя бактерии гиперэкспрессировать этот белок, то есть синтезировать в больших количествах. Затем белок выделяют из бактерий, очищают и кристаллизуют, чтобы потом по картинке рентгеновского рассеяния восстановить структуру белка.

Серьёзные проблемы могут возникнуть уже на первом этапе – экспрессии, когда надо получить структуру целевого белка. Решаются они путём перебора различных методов, известных на данный момент, что довольно долго и дорого. Авторы статьи предложили чёткий алгоритм, который позволит решать проблемы экспрессии систематическим способом, что значительно ускоряет этот этап исследований.

Для белка, у которого наблюдаются проблемы с экспрессией, подбирают другой, похожий на него (гомологичный) белок, чья экспрессия идёт лучше (этот белок называют драйвером экспрессии, или просто драйвером). Затем синтезируются химеры, «сшитые» из частей целевого белка и драйвера таким образом, что довольно быстро удаётся определить, какой участок целевого белка «виноват» в низком уровне экспрессии.

«Можно сделать две различные химеры, заменив одну из половин целевого белка на половину драйвера. Проверяется экспрессия получившихся химер. Исходя из того, какая из них экспрессируется лучше, определяем, в какой половине белка находится место, которое мешает экспрессии. Далее переходим ко второй итерации, сделав две новые химеры на основе той химеры, которая лучше экспрессировалась в первой итерации, и уменьшив тем самым в этой химере вдвое долю драйвера. Проверяется экспрессия новых химер, выясняется, какая часть препятствует экспрессии… И так далее, пока не выясним, в чём точно заключается проблема», – поясняет Дмитрий Братанов, первый автор статьи, опубликованной в журнале PLOS ONE.

В итоге обнаруживается необходимая мутация за 2lg2N экспрессий белка, в то время как случайный её поиск требует 2N итераций (N – количество аминокислот в его цепочке).

Преимущество нового алгоритма видно на примере небольшого белка из 200 аминокислот: для него потребуется синтезировать не более 16 различных химер, в то время как при случайном переборе необходимо синтезировать порядка 1060 различных белков – больше, чем во всех живых организмах на планете.

Используя этот алгоритм, учёные МФТИ получили химеру бактериородопсина из бактерии H. halobium. Структура его известна уже давно, но сам он при этом выделялся из родных для него клеток, работа с которыми довольно затруднительна и требует больше времени, чем работа с кишечной палочкой. В E. coli учёные пытаются экспрессировать бактериородопсин уже около 30 лет, но до сих пор методы, применявшиеся к этой задаче, не позволяли получить его в больших количествах и в той форме, в которой белок функционирует в клетке.

Бактериородопсин – важный модельный белок для проверки различных теорий, связанных с мембранными белками в целом. Алгоритм, предложенный учёными, позволит получать его без использования экзотических методов экспрессии, что существенно упростит доступ к работе с мембранными белками в лабораториях во всём мире. Кроме того, существует несколько десятков изобретений на основе бактериородопсина, использующихся в различных отраслях – от биомедицины и биотехнологий до создания оптических инструментов (лазеров, например) и измерительных систем.

Получение белков, последовательность которых чем-либо отличается от исходной, является стандартным методом улучшения экспрессии, но до сих пор этот метод модифицировался индивидуально под каждый белок.

«В основном стратегия предыдущих подходов следующая. На один из концов белка дополнительно помещаются различные полипептидные последовательности (теги), которые могут быть экспрессионными, кристаллизационными и т.д. При этом используется стратегия «пан-или-пропал». Повезло – белок стал экспрессироваться, не повезло – попробуем следующий тег. Чаще всего в процессе очистки белка такая последовательность удаляется. Мы же предложили подход, который позволяет систематическим образом выявлять проблемы, приводящие к отсутствию экспрессии белка. Предполагается, что получившийся химерный белок будет иметь незначительные изменения по сравнению с целевым белком», – рассказывает Валентин Горделий, главный автор исследования.

Использование предложенного метода в перспективе значительно ускорит процессы исследования мембранных белков, что может изменить стратегию синтеза лекарств и даст возможность с помощью компьютерного моделирования находить новые действующие вещества быстрее и точнее.

Изучение мембранных белков важно и для новой науки – оптогенетики, которая уже сейчас открывает новые возможности для исследования нейродегенеративных заболеваний – болезни Альцгеймера или Паркинсона. Результаты исследования будут востребованы создаваемым в МФТИ Центром старения.